GLOSSARI DE TERMES DE BIOLOGIA MOLECULAR

Kb: kilobases (1000 parells de bases)

O/N: overnight. Tota la nit.

pb: parells de bases.

rpm: revolucions per minut.

R/T: room temperature. Temperatura ambient.

Incorporació d'un fragment d'ADN forà (al que anomenem insert) en una molècula petita capaç de replicar-se per ella mateixa (plasmidi o vector bacterià). El resultat de la unió de l'insert i el vector és el que s'anomena ADN recombinant.

Cèl·lules bacterianes que tenen la capacitat d'adquirir ADN recombinant present en el medi que les envolta. Aquesta procés s’anomena transformació. Durant la transformació es provoca la permeabilització de la membrana durant uns minuts, el que permet l'entrada de l'ADN recombinant sense malmetre les cèl·lules.

L'electroforesi és una tècnica de laboratori que serveix per separar molècules presents en mescles. Es basa en les propietats biofísiques (mida, forma, càrrega elèctrica, o punt isoelèctric). Consisteix en el transport de molècules sota l'acció d'un camp elèctric.

L'electroforesi en gel d'agarosa s’utilitza per separar una mescla de molècules d’ADN o ARN per llargada/mida. Les molècules d'àcid nucleic, carregades negativament, se separen a través d'una matriu d'agarosa migrant del pol negatiu al positiu. Les molècules més petites es desplacen més que les grans dins la matriu.

Enzims que tallen ADN de doble cadena específicament en una seqüència concreta. La seqüència que reconeix cada enzim s’anomena diana de restricció. Generalment són seqüències palindròmiques de 4 a 6 nucleòtids.

Fragment d’ADN de doble cadena que introduïm (clonem) en el vector de clonació.

Tècnica que permet obtenir moltes còpies d'un fragment d'ADN de doble cadena mitjançant l'acció de l'enzim ADN Taq polimerasa.

Tècnica que serveix per determinar la seqüència nucleotídica d’un fragment d’ADN. Es basa en una modificació de la PCR seguida d’una electroforesi capil·lar. En la PCR s’utilitzen nucleòtids (dNTPs) i dideoxinucleòtids (ddNTPs); aquests últims marcats amb fluoròfors de 4 colors diferents que al ser incorporats a la cadena d’ADN impedeixen que s’incorpori un altre nucleòtid després d’ells. Al final de la PCR tindrem molècules d’ADN de tantes mides diferents com nucleòtids tingui el fragment que seqüenciem. La PCR es resol mitjançant una electroforesi capil·lar on les molècules s’ordenen per mida (diferint en un sol nuclèotid entre elles) acloplada a un detector que llegeix la fluorescència de cada ddNTP que finalitza una molècula d’ADN. El resultat final és un cromatograma on cada pic de fluerescència correspon a un nucleòtid de la seqüència del fragment d’ADN inicial.

• Restricció-lligació: Consisteix en clonar un insert en un vector utilitzant enzims de restricció i l’enzim lligasa. El vector de clonació i l’insert es preparen utilitzant enzims de restricció (obren el vector en cas de que estigui tancat i fan que els extrems de l’insert siguin compatibles amb el vector obert). Vector i insert s’uneixen utilitzant l’enzim lligasa.

• Recombinació Gateway: Consisteix en clonar un insert en un vector utilitzant seqüències que poden fer recombinació homòloga (és a dir, vector i insert presenten seqüències de nucleòtids molt similars que s’intercanvien). Aquestes seqüències es troben en el vector i s’afegeixen als extrems de l’insert mitjançant PCR.

Molècula d’ADN de doble cadena sovint d’origen bacterià que pot incorporar i replicar fragments d'ADN forà (inserts) els quals han estat introduïts en ell mitjançant tècniques de biologia molecular.

El vector que conté un fragment d'ADN forà s'anomena vector recombinant o ADN recombinant.

Tot vector de clonació ha de contenir els elements següents:

• Origen de replicació: regió que codifica per a l'inici de la síntesi del ADN, que li permet replicar-se de manera independent a l’ADN cromosòmic, ja sigui en un sistema bacterià o en llevat.

• Gens de selecció: gens que permeten la identificació i selecció dels clons recombinants. En són exemples els gens que codifiquen per a la resistència a antibiòtics, marcadors metabòlics com el gen Lac Z, o marcadors auxotròfics, utilitzats en llevat.

• Polylinker o lloc de multiclonació: Regió que permet la inserció del fragment d’ADN (insert) que es vol clonar en un vector. Pot tenir múltiples dianes d’enzims de restricció.