Embedded Files
Durada aproximada del protocol: 3 hores
DESCRIPCIÓ
La reacció en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR) és una tècnica de biologia molecular comunament usada per amplificar ADN, és a dir, obtenir un gran nombre de còpies d’un fragment de ADN. Va ser ideada al 1986 per Kary Mullis. La tècnica es basa en la propietat de les ADN polimerases de replicar cadenes de ADN.
L’ADN polimerasa ha de ser capaç de suportar les altes temperatures (de més de 90°C) necessàries per a la separació de les dues cadenes d’ADN de la doble hèlix després de cada cicle de replicació. Thermus aquaticus es caracteritza per tolerar altes temperatures i per això en la PCR es fa servir l'enzim ADN Taq polimerasa obtinguda d’aquest procariota.
REACTIUS I COMPONENTS QUÍMICS DE LA PCR
REACTIUS I COMPONENTS QUÍMICS
REACTIUS I COMPONENTS QUÍMICS
DESOXINUCLEÒTIDS TRIFOSFAT (dNTPs):
Els nucleòtids són les unitats estructurals bàsiques dels àcids nucleics. Són necessaris per formar les noves cadenes d’ADN.
ENCEBEDORS / INICIADORS / OLIGONUCLEÒTIDS / PRIMER:
Seqüències de 6-40 nucleòtids complementàries a una de les dues cadenes d’ADN. Normalment tenen entre 18 i 22 nucleòtids. Són reconeguts per la polimerasa permetent iniciar la reacció. Han d'estar situats un en cada cadena i a poca distància. Delimiten la zona d’ADN per amplificar. Són imprescindibles ja que les ADN polimerases només poden afegir nucleòtids nous a una cadena ja existent d’ADN.
IONS DIVALENTS:
S’acostuma a utilitzar magnesi (Mg+2), agregat habitualment en forma de clorur de magnesi (MgCl2) o un altre catió divalent. Actuen com a cofactors de la polimerasa.
IONS MONOVALENTS:
Els cations monovalents interactuen amb els grups fosfats dels àcids nucleics incrementant l'estabilitat de les cadenes, com el potassi.
SOLUCIÓ TAMPÓ / BUFFER :
Manté el pH adequat pel funcionament de l’ADN polimerasa. Pot incloure els dos ions comentats anteriorment.
ADN POLIMERASA:
La més comú és la Taq polimerasa.
ADN MOTLLE:
Conté la regió d’ADN que es vol amplificar.
APARELL
APARELL
TERMOCICLADOR / MÀQUINA DE PCR :
El termociclador és l'aparell que permet variar la temperatura de les mostres durant la reacció de PCR de forma automàtica i programada. Les diferents fases de la PCR es caracteritzen per dur-se a terme a diferents temperatures, i en series de 20 a 35 repeticions (anomenades cicles).
FASES DE LA PCR
FASES DE LA PCR
INICIACIÓ:
Aquest pas consisteix a escalfar la mostra fins a una temperatura de 94-96 °C durant uns minuts, només necessari si la DNA polimerasa requereix l'activació per calor.
DESNATURALITZACIÓ INCIAL:
Les dues cadenes d’ADN es separen incrementant la temperatura fins a 94-95 °C (és la més habitual).
DESNATURALITZACIÓ:
Les dues cadenes d’ADN es separen incrementant la temperatura fins a 94-95°C.
ANELLAMENT / UNIÓ DE L'ENCEBADOR :
L'encebador s’uneix (hibridació) a la seva seqüència complementària de l’ADN motlle. Cal baixar la temperatura a 50-65 °C durant uns segons, permetent així la unió. Per tal d'establir uns ponts d'hidrogen estables entre les cadenes d’ADN (unió ADN-ADN) és indispensable que la seqüència de l'encebador sigui homòloga a la de l’ADN motlle.
Temperatura d'anellament dels encebadors:
La temperatura de fusió (Tm, de l’anglès melting) és la temperatura a la qual la meitat d'una doble cadena d’ADN està dissociada.
La longitud de l’encebador i la seva seqüència nucleotídica són d'importància crítica en el disseny del programa de PCR. La Tm d'una doble cadena d'àcid nucleic augmenta tant amb la seva longitud com amb el contingut de G i C. Una fórmula simple per al seu càlcul és: Tm (°C) = 4 (G + C) + 2 (A + T) .
La temperatura d'anellament recomanada per una parella d'encebadors en una PCR és la Tm menor de la parella d'encebadors menys 5 °C.
EXTENSIÓ / ALLARGAMENT DE LA CADENA:
L'encebador és el suport inicial necessari per a que l’ADN polimerasa pugui acoblar-se a la cadena motlle i iniciar la síntesi d'una nova cadena d'ADN, coneguda com cadena d'ADN complementària. Per a realitzar aquest procés, cal que la mostra estigui a una temperatura de 70–75 °C.
La polimerasa sintetitza la nova cadena d’ADN afegint els dNTPs complementaris sempre en direcció 5' → 3', unint el grup 5' -fosfat dels dNTP al grup 3'- hidroxil del final de la cadena d’ADN creixent.
La temperatura d'aquest pas depèn de l’ADN polimerasa que es faci servir. Per la Taq polimerasa, la temperatura de màxima activitat està entre 70 i 80 °C (habitualment 72 °C).
El temps d'extensió depèn tant de l’ADN polimerasa utilitzada com de la longitud del fragment d’ADN a amplificar. Com a norma general, a la seva temperatura òptima, la polimerasa d’ADN és capaç de polimeritzar mil bases en un minut.
ALLARGAMENT FINAL:
Etapa única que es porta a terme una temperatura de 70-74 °C durant 5-15 minuts després de l'últim cicle. Aquesta etapa assegura que no quedi ADN de cadena senzilla de la zona amplificada.
CONSERVACIÓ:
En aquesta etapa final la temperatura es manté entre 4-20 °C durant un període de temps indefinit per a conservar el resultat de la reacció a curt termini.
MATERIALS I EQUIPS NECESSARIS:
APARELLS:
Termocicldor
AGENTS I REACTIUS:
Parell d’encebadors/primers
Desoxiribonucleòtids trifosfat (dNTPs)
ADN polimerasa (Taq polimerasa)
Tampó Taq polimerasa
(MgCl2)
Aigua destil·lada estèril
MOSTRES:
ADN genòmic
Control positiu
Control negatiu
ALTRES:
Guants
Retolador per escriure sobre plàstic
Microtubs per PCR de 0,2 mL
Pipeta 10-100 µL
Pipeta 0,5-10 µL
Pipeta 0,1-2 µL
Puntes 10 µL (blanques)
Puntes 100 µL (grogues)
Gel
METODOLOGIA
Atenció: En aquest protocol es requereixen l’ús de guants i bata.
Realitzar els càlculs per tenir cadascun dels components de la PCR en les següents concentracions, tenint en compte que el volum de reacció és de 50 µl (Taula 1).
2. En un microtub de 0,2 mL ben etiquetat, es prepara la barreja de reacció, començant pels volums més grans i acabant per la Taq polimerasa.
3. Un cop preparades les mostres s'introdueixen al termociclador, i s'inicia el programa de PCR (Taula 2).
Programa de PCR:
Durada del programa: 2 hores aprox.
INFORMACIÓ ADDICIONAL:
Solyc06g074910 genomic sequence
ATGGGAAGAGCTCCTTGTTGTGATAAGAATAATGTTAAAAGAGGGCCATGGTCACCAGAAGAAGATGCTAAGCTTAAAGAATTCATTGAAAAATATGGAACTGGTGGTAATTGGATTGCTCTTCCTCTAAAAGCTGGTAAGTTTAGTCGAACTCAGTAACTTATAGTTCAAACCTTTTGTATTTATTTTAGAAAATTCACTTAATATATGTACATCCAATAATATAACAACAACAATATGTATAGTGTAATTTCATGAATAAGTTAAACGAGGATAGGATGTTATATGCAGATGTTACTCCTACAAATGTTGAGTAGAAAAGTATAAACCCTTAGATTCAAAAGAAAGGAAGAATTTTGAAATTAGACAATAAAATATCAGGTTACAAAGCAAATGAAGCAATAAACAATAGTAATAAACACTAAAGAAAAAGAAATAACAAAGAGTACGTTCGAAATTTTTAGAACCAATAAAGTTCAAATCTTGACCATAAAAAGTATTTCTTTTATATTTTCTATTTATATAATTTGATGAGATTATGGTTTTAAATCAGGATTAAAGAGATGTGGAAAGAGCTGCAGATTAAGATGGCTAAATTATCTAAGGCCAAATATAAAGCATGGTGATTTTTCTGATGAAGAAGATAGGGTAATATGCAGTTTATATGCCAGCATTGGGAGCAGGTGACAAACTTTTTAATTAAGTCAAAATTATTTAACAGTTTTTCCTCTCTTTTTTTTTTCCTGTTTTGGTCACTAATTATCTACCACTACCTTCATTTTACCTTCAATTTCTTCACTCATCATGTATTTGCATATGACTTTTGAGACAAAAGTAAATCCCATAAATTTTAAAAAAAGAAATTGAAAGAAGAACTTCAATGGTGTAGAAAATAAATATTAATTAAGACTCAAAGAAAAGTAATAATTTAATTTTGTTGGGTTCTGACTGAAGATTCTACAATTTTTATGGATATTTCATCTGCATGCATGCCAGTTTTAGATCTTGGATCAAGTCCTTAATTACAGCTGTTAGGACACAGTCCATAAAATGTAAAACTATTCTAAGTTTCTTGATAAAACAACTTATGTATAGCACCTACGGTTAGATTTCTCTAAAACAATATTTATTATTACAGTCAAGATAATTTGAAATCAATTTTCCATGTTTATAACAATACTTTGCTAAAACAACTAAAATATATCCAAACAAACAATTTTATTATAAAAATATTTAACTATATATCTTATCAATTTGAGTTTAAATTTTCTATGACATGTAACTTTTTTGTAACAAGTTTGATATACTTAAAAGTTGATTAAATTGAATAATAAACATCTATAGATGGTTAAATCAAATTTTAAAATGCCAAATTATTTATATGTTGAATATATATTATAACGTAAATGATGTTGTACATTTATACAGGTGGTCAATTATAGCAGCTCAGTTACCAGGGAGGACCGACAATGATATTAAAAACTATTGGAACACAAAGCTTAAGAAGAAGCTCATGGGTTTTATTCAGTCATCATCTAATATTAACCAGAGAACTAAATCACCTAATTTATTATTCCCTCCTACAAGTACTCTTCAAACAACTTTTCAATCCCAATCTCAAGCATCAATTTCAAATCTTTTAAGAGATTCATATGTAGAGCCCATTCCACTAGTCCAACCAAATTTCATGTACAACAACAATAACATGATGAACTTTCAATTAGGTACAAATAATCAACATTCTTATAATTTTCATGATCAAAGCTTAATGAATCCCATGCAAACAATTAGTTCTTGTTCTTCATCTGATGGTCTAAGTTGCAAACAAATTAGCTATGGCAATGAGGAAATGATGTGTCAAATTCCTTTTGAAGAAACCCAAAAGTTTACACTTGACAATTATTGTACTACTTGGGCTGATCATCAAAAGACAAATGGATATTTTGGGAATAACTTTCAAAGTAGTCAATTCCAGTATGATGATCATACTAATATTGAAGAAATTAAGGAGTTGATTAGTAGTAGCTCTAGTAATGGCAATGGATGTAACAATGTAGGGTACTGGGGTTAATTTTAATTTTATTTTGTAGGTGTGAGTACTTGTAAGTTTTAATGAAATTTATTCATGGAAAGCTTTTATTTTGCTTCCACTGAATTAGGA
Taula 3. Seqüència dels encebadors disponibles per al gen C (Solyc06g074910)
Taula 4. Mida dels productes de PCR amplificats amb cadascuna de les parelles de primers mostrades.
Page updated
Report abuse