7. SELECCIÓ DE COLÒNIES
Durada aproximada del protocol: 3 hores - 2 dies
DESCRIPCIÓ
Les colònies que contenen l’ADN recombinant del nostre interès es poden seleccionar:
Per resistència a antibiòtics i color (sistema operó lac).
Per PCR, utilitzant encebadors específics.
Per digestió.
SELECCIÓ PER RESISTÈNCIA A ANTIBIÒTICS I COLOR (sistemes operó lac Z):
En plaques amb l'antibiòtic ampicil·lina, només creixen colònies de bacteris que continguin el vector pGEM.
En presència en el medi de l'inductor IPTG i el substrat X-Gal, la beta-galactosidasa el metabolitza i dona lloc a un precipitat de color blau. Així doncs, les colònies blaves són bacteris que han incorporat el vector sense insert, mentre que les blanques són bacteris que contenen el vector amb l'insert (és a dir, l'ADN recombinant que volíem obtenir).
Figura 1. Gens de selecció presents en el vector de clonatge pGEM-T easy.
Figura 2. Selecció dels bacteris transformats amb l'insert d'interès.
SELECCIÓ PER PCR, UTILITANT ENCEBADORS ESPECÍFICS:
La tècnica de la PCR també pot utilitzar-se per determinar la presència o absència d'una seqüència o insert en la colònia bacteriana resultant de la transformació d'un bacteri amb un determinat ADN recombinant. En aquest cas, al treballar amb cèl·lules no pipetegem cap volum d’ADN motlle en la reacció de PCR, si no que punxem la colònia amb una punta de pipeta fina i introduïm aquesta en la barreja de reacció.
La barreja de reacció i les condicions de PCR s’establiran igual que hem explicat en el protocol 2.
SELECCIÓ PER DIGESTIÓ:
Per a realitzar aquest tipus de selecció cal que primer fem créixer cultius líquids (protocol 8) a partir de les colònies blanques crescudes en les nostres plaques. Després, obtindrem l’ADN plasmídic multiplicat en el seu interior mitjançant una extracció d’ADN plasmídic o minipreparació (protocol 9). Seleccionarem enzims de restricció que ens donin un patró de bandes inequívoc que informi de la presència del nostre insert d’interès en l’ADN recombinant.
A continuació es barrejarà l’ADN, l’enzim de restricció i el tampó que garanteix les condicions òptimes de reacció. El resultat de la digestió es comprovarà mitjançant electroforesi en gel d’agarosa (protocol 3).