1. EXTRACCIÓ D' ADN GENÒMIC

Durada aproximada del protocol: 3 hores

DESCRIPCIÓ

Farem servir un protocol d’extracció d’ADN genòmic manual típicament emprat per plantes. Aquest ADN posteriorment es podrà utilitzar com a motlle per a la reacció en cadena de la polimerasa (PCR).

TAMPÓ I REACTIUS UTILITZATS EN LA PRÀCTICA

TAMPÓ CTAB:

El CTAB (Hexadecyl trimethyl-ammonium bromide) s’uneix i precipita els polisacàrids integrats o associats a la membrana. Els polisacàrids co-precipiten amb l’ADN i poden inhibir els enzims. No hi ha cap mètode que pugui garantir una neteja total de polisacàrids.

PVP (Polyvinylpyrrolidone):

S’uneix i precipita els polifenols. En plantes amb altes concentracions de compostos fenòlics (per exemple, la maduixa) el 2% de PVP pot millorar la qualitat de l’ADN. Els productes d’oxidació de compostos fenòlics redueixen l’eficiència de l’extracció de l’ADN.

TRIS:

Manté el pH i estabilitza els àcids nucleics.

EDTA:

Quelant de Mg+2 que inhibeix l’activitat nucleasa.

AGENTS REDUCTORS:

Com el 2-β-mercaptoethanol o bisulfit sòdic dissolen els polifenols, desnaturalitzen les proteïnes i elimina les nucleases. Poden augmentar el rendiment en la recuperació de l’ADN.

DISSOLVENTS ORGÀNICS:

Com el fenol i el cloroform eliminen les proteïnes.

ALCOHOLS:

Com l’etanol i l’isopropanol precipiten àcids nucleics. També s’utilitzen per netejar-los.

AIGUA I TAMPONS AQUOSOS:

Dissolen els àcids nucleics. S’utilitzen per resuspendre’ls.

MATERIALS I EQUIPS NECESSARIS

  • Fulles joves de tomaquera

  • Microtubs de 1.5 ml

  • Micropipetes 10µl -100µl i 100µl-1000µl

  • Tampó CTAB (Tris‐HCl 0.1M pH 8.4, NaCl 1.4 M, EDTA 25 mM pH 7.5, CTAB 2%, PVP 2%)

  • Fenol:Cloroform isoamylalcohol (1:1)

  • Cloroform isoamylalcohol (24:1)

  • Etanol absolut

  • Pipetes i puntes estèrils

  • Vòrtex

  • Centrífuga de sobretaula per microtubs

  • Guants

  • Retoladors

  • Gradetes per a tubs

  • Campana de fums

METODOLOGIA

Atenció: En aquest protocol es fan servir reactius que requereixen l’ús de bata i guants de protecció i es treballa sota campana de fums (extracció de gasos).

  1. En un microtub, prendre una mostra de material vegetal. S’acostuma a agafar una fulla jove de la mida de la punta del dit.

  2. Triturar la mostra amb un èmbol fins que quedi totalment disgregada.

  3. Afegir 500 µL de tampó CTAB i acabar de triturar.

  4. Incubar a 65ºC durant 20 min.

  5. Afegir 500 µL de Fenol: Cloroform isoamylalcohol (1:1).

  6. Agitar amb el vòrtex i centrifugar els tubs durant 5 min. a 10000 rpm.

  7. Recollir 440 µL de la fase superior i transferint-los a un nou tub.

  8. Afegir-hi un volum (440 µL) de Cloroform isoamylalcohol.

  9. Agitar amb el vòrtex i centrifugar els tubs durant 5 min., a 10000 rpm.

  10. Recollir la fase superior transferint-la a un nou tub i afegir-hi 750 µl d’etanol absolut fred.

  11. Barrejar per decantació amb la mà.

  12. Deixar precipitar a -20ºC durant 10 min.

  13. Centrifugar 5 min. a 10000 rpm.

  14. Eliminar bé el sobrenedant

  15. Deixar assecar totalment el precipitat (pellet) a temperatura ambient (mínim 10-15 min).

  16. Resuspendre el precipitat que conté l’ADN en 20 µL d’aigua estèril.

  17. Guardar-ho a 4ºC (si s’utilitzarà immediatament) o a -20ºC.