Embedded Files
Durada aproximada del protocol: 3 hores
DESCRIPCIÓ
Farem servir un protocol d’extracció d’ADN genòmic manual típicament emprat per plantes. Aquest ADN posteriorment es podrà utilitzar com a motlle per a la reacció en cadena de la polimerasa (PCR).
TAMPÓ I REACTIUS UTILITZATS EN LA PRÀCTICA
TAMPÓ CTAB:
El CTAB (Hexadecyl trimethyl-ammonium bromide) s’uneix i precipita els polisacàrids integrats o associats a la membrana. Els polisacàrids co-precipiten amb l’ADN i poden inhibir els enzims. No hi ha cap mètode que pugui garantir una neteja total de polisacàrids.
PVP (Polyvinylpyrrolidone):
S’uneix i precipita els polifenols. En plantes amb altes concentracions de compostos fenòlics (per exemple, la maduixa) el 2% de PVP pot millorar la qualitat de l’ADN. Els productes d’oxidació de compostos fenòlics redueixen l’eficiència de l’extracció de l’ADN.
TRIS:
Manté el pH i estabilitza els àcids nucleics.
EDTA:
Quelant de Mg+2 que inhibeix l’activitat nucleasa.
AGENTS REDUCTORS:
Com el 2-β-mercaptoethanol o bisulfit sòdic dissolen els polifenols, desnaturalitzen les proteïnes i elimina les nucleases. Poden augmentar el rendiment en la recuperació de l’ADN.
DISSOLVENTS ORGÀNICS:
Com el fenol i el cloroform eliminen les proteïnes.
ALCOHOLS:
Com l’etanol i l’isopropanol precipiten àcids nucleics. També s’utilitzen per netejar-los.
AIGUA I TAMPONS AQUOSOS:
Dissolen els àcids nucleics. S’utilitzen per resuspendre’ls.
MATERIALS I EQUIPS NECESSARIS
Fulles joves de tomaquera
Microtubs de 1.5 ml
Micropipetes 10µl -100µl i 100µl-1000µl
Tampó CTAB (Tris‐HCl 0.1M pH 8.4, NaCl 1.4 M, EDTA 25 mM pH 7.5, CTAB 2%, PVP 2%)
Fenol:Cloroform isoamylalcohol (1:1)
Cloroform isoamylalcohol (24:1)
Etanol absolut
Pipetes i puntes estèrils
Vòrtex
Centrífuga de sobretaula per microtubs
Guants
Retoladors
Gradetes per a tubs
Campana de fums
METODOLOGIA
Atenció: En aquest protocol es fan servir reactius que requereixen l’ús de bata i guants de protecció i es treballa sota campana de fums (extracció de gasos).
En un microtub, prendre una mostra de material vegetal. S’acostuma a agafar una fulla jove de la mida de la punta del dit.
Triturar la mostra amb un èmbol fins que quedi totalment disgregada.
Afegir 500 µL de tampó CTAB i acabar de triturar.
Incubar a 65ºC durant 20 min.
Afegir 500 µL de Fenol: Cloroform isoamylalcohol (1:1).
Agitar amb el vòrtex i centrifugar els tubs durant 5 min. a 10000 rpm.
Recollir 440 µL de la fase superior i transferint-los a un nou tub.
Afegir-hi un volum (440 µL) de Cloroform isoamylalcohol.
Agitar amb el vòrtex i centrifugar els tubs durant 5 min., a 10000 rpm.
Recollir la fase superior transferint-la a un nou tub i afegir-hi 750 µl d’etanol absolut fred.
Barrejar per decantació amb la mà.
Deixar precipitar a -20ºC durant 10 min.
Centrifugar 5 min. a 10000 rpm.
Eliminar bé el sobrenedant
Deixar assecar totalment el precipitat (pellet) a temperatura ambient (mínim 10-15 min).
Resuspendre el precipitat que conté l’ADN en 20 µL d’aigua estèril.
Guardar-ho a 4ºC (si s’utilitzarà immediatament) o a -20ºC.
Page updated
Report abuse