3. ELECTROFORESI D'ADN EN GEL D'AGAROSA
Durada aproximada del protocol: 2 hores
DESCRIPCIÓ
L'electroforesi és una tècnica de laboratori que serveix per separar molècules presents en mescles. La tècnica es basa en les propietats biofísiques (mida, forma, càrrega elèctrica, o punt isoelèctric). L'electroforesi en gel té usualment un propòsit analític, encara que també es pot fer servir per preparar la mostra per altres tècniques.
En biologia molecular s'empra l'electroforesi en gel d'agarosa per separar una mescla de fragments de DNA o RNA amb un propòsit analític.
A l'aplicar un camp elèctric, les molècules d'àcid nucleic, carregades negativament, es mouran a través de la matriu d'agarosa. La migració està determinada principalment per la llargada/mida de la molècula: les molècules més petites es mouen més ràpidament que les grans.
Durant el procés, els àcids nucleics no s’alteren degut al tampó present en el gel i en la cubeta d'electroforesi. Aquest evita canvis de pH deguts al camp elèctric (s’ha de tenir en compte que la temperatura por augmentar pel pas de la corrent pel gel).
REACTIUS UTILITZATS EN LA PRÀCTICA
AGAROSA:
Polisacàrid format per galactosa (alfa i beta) que s'extreu de les algues. És un dels principals components de l’agar. L’agarosa està disponible com una pols blanca que es dissol en l'aigua prop de punt d'ebullició, i forma un gel quan es refreda (gelificació de 35-42 °C, fusió de 85-95 °C ).
Els gels d'agarosa per ADN es fan entre un 0,8% (bona separació o resolució de fragments grans d’ADN de 5-10 kb) i un 2% d'agarosa dissolta en tampó d'electroforesi (bona resolució per a fragments petits de 0,2-1 kb).
AGENT INTERCALANT:
Uns dels colorants més utilitzat per fer visibles bandes de DNA per a l'electroforesi en gel d'agarosa era el bromur d'etidi (EtBr). Aquest, quan s'intercala entre la doble cadena d’ADN, emet fluorescència quan s'exposa a la llum ultraviolada. El bromur d'etidi és un conegut mutagen, i hi ha alternatives més segures disponibles (SYBR Green, SYBR Safe, GelRed...).
TAMPÓ D'ELECTROFORESI:
Evita canvis de pH deguts al camp elèctric. Per a d'àcids nucleics els més comuns són el tampó TAE (Tris/acetat/EDTA) i el TBE (Tris/borat/EDTA). El tampó TAE té la capacitat d'amortiment més baixa però proporciona una millor resolució per DNA més gran, i el TBE per ADN més petit.
MARCADOR DE PES MOLECULAR:
Mescla de fragments d'ADN de mida coneguda.
MATERIALS I EQUIPS NECESSARIS
Erlenmeyer 250 ml
Espàtula
APARELLS:
Font d’alimentació per a electroforesi
Cubeta electroforesi
Motlle per al gel =Portagels
Pinta per fer els pouets
AGENTS I REACTIUS:
Tampó TBE (Tris 100 mM, EDTA 2mM, àcid bòric 90 mM)
Agarosa per biologia molecular
Marcador de pes molecular (mescla de fragments de DNA de mida coneguda)
Agent intercalant per visualitzar el DNA Syber Safe
Tampó de càrrega
Mostres d’ADN (poden tenir diferent origen)
ALTRES:
Guants
Retolador per escriure sobre plàstic
Microtubs per PCR de 0,2 mL
Pipeta 10-100 µL
Pipeta 0,5-10 µL
Puntes 2 µL
Puntes 10 µL
Puntes 100 µL
METODOLOGIA
Atenció: En aquest protocol es fan servir reactius que requereixen l’ús de bata i guants de protecció A més, es pot requerir l’ús d’ulleres de seguretat per a visualitzar l’ADN en el gel.
PREPARACIÓ GEL:
Es treballarà sempre amb guants. El gel es fa amb el mateix tampó que farem servir per a l’electroforesi, en aquest cas TBE 1X.
Preparar el motlle per al gel (directament a la cubeta o en suport especial). En el nostre cas, el volum total del gel pel suport que fem servir és de 100 ml.
Pesa l’agarosa necessària per obtenir un gel al 1% (p/v).
Col·locar l’agarosa en un Erlenmeyer de 250 ml i afegir el volum necessari de tampó TBE 1X. Portar la mescla d’agarosa i TBE 1X al microones i fondre l'agarosa. S’escalfa al microones permetent la perfecta dissolució, fer-ho en més d’una fase controlant visualment la dissolució.
Deixar refredar la mesclar fins a uns 60ºC. Afegir el SYBRsafe (8 µl per 100 ml) i agitar per homogeneïtzar.
Abocar la mescla a la cubeta portagels, amb la pinta que definirà els pouets, i deixar que es refredi durant uns 20-30 minuts.
PREPARACIÓ I CÀRREGA DE LES MOSTRES:
Abans de dipositar les mostres en els pouets, les hem de preparar:
A cada pouet hi caben 25 µl (depèn del gruix del gel), en els quals afegirem una mescla que inclou la mostra d’ADN i un tampó de càrrega, que és un colorant, que ens mostra l’avanç amb llum visible, ja que l’agent intercalant que fem servir per l’ADN només és visible amb llum UV.
Aquest colorant, de més alta densitat perquè conté glicerol, també arrossega la mostra al fons del pouet. La mostra i tampó de càrrega es diposita al fons del pouet i no difon pel tampó que omple la cubeta i cobreix el gel. D'aquesta manera la mostra es manté concentrada.
Si la mostra d’ADN no té tampó de càrrega inclòs (com tenen alguns tampons de PCR) la prepararem de la següent manera:
ADN 4 µL
Tampó de càrrega 6X 4 µL
H2O 16 µL
Volum total 24 µL
La mescla es pot fer en un microtub.
Per carregar el gel, normalment es carrega el marcador de pes molecular en el primer carril, i a continuació les mostres en els carrils següents. Per últim s’acostumen a carregar els controls.
ELECTROFORESI:
Per fer l’electroforesi, necessitem omplir la cubeta amb el mateix tampó amb el que hem fet el gel (TBE 1X) i submergir el gel en aquest tampó.
Col·locar la tapa de la cubeta, controlant que els borns negatiu i positiu coincideixen (vermell/vermell i negre/negre ).
Connectar la cubeta a la font d’alimentació.
Activar la font i deixar córrer 45 minuts a 100V. El temps depèn del voltatge i de la concentració del gel d’agarosa, però el colorant que hem posat ens permet veure més o menys el front de electroforesi.
VISUALITZACIÓ:
Treure el gel de la cubeta portar-lo al transil·luminador, col·locar-lo al damunt i encendre la llum UV després de baixar la tapa i fer servir les proteccions individuals (ulleres especials, EPI) i la pell.
Identificar les bandes que poguessin aparèixer.
Fotografiar el resultat i interpretar-lo.