9. EXTRACCIÓ ADN PLASMÍDIC (recombinant)

En general es parla de dos mètodes d’extracció d'ADN plasmídic depenent del grau de puresa desitjat. Per obtenir ADN d’alta qualitat que volem seqüenciar s’acostumen a utilizar kits comercials seguint les indicacions del fabricant.

També es pot extreure ADN recombinant fent minipreparacions mitjançant lisi alcalina.

• Cultiu bacterià líquid.

• Tampons P1, P2 i P3.

• Etanol 70%.

• Tampó TE 1x.

• Microtubs de 1’5 mL.

• Micropipetes 10µl -100µl i 100µl-1000µl.

• Puntes estèrils

• Centrífuga per a microtubs.

Minipreparació mitjançant lisi alcalina. Mètode descrit per Bimboin i Doly (1979), amb modificacions posteriors de Sambrook (2001).

Procediment:

1. Inocular una colònia aïllada en 3 mL de cultiu amb l’antibiòtic adient, incubar a 37ºC en agitació a 250 rpm O/N.

2. Transferir tot el cultiu a un tub eppendorf i centrifugar 1 min. a velocitat màxima (≈ 13000 rpm). Descartar el sobrenedant.

3. Afegir 150 μL de tampó P1. Resuspendre bé el sediment de bacteris amb l’ajuda del vòrtex.

4. Afegir 150 μL del tampó P2. Agitar suaument el tub per inversió unes 4-5 vegades. Incubar no més de 5 min. a TA.

5. Afegir 150 μL del tampó P3 i barrejar immediatament per inversió unes 4-5 vegades. Deixar reposar 15-20 min. en gel. Centrifugar 10 min a velocitat màxima (≈ 13000 rpm).

6. Passar el sobrenedant a un nou tub eppendorf, afegint-hi 900 μL d’etanol 100%. Incubar 2 min. a TA. Centrifugar 10 min a velocitat màxima (≈ 13000 rpm).

7. Descartar el sobrenedant i afegir 700 μL d’etanol 70%. Centrifugar 5 min. a velocitat màxima (≈ 13000 rpm).

8. Decantar l’etanol i deixar assecar l'ADN a l’aire 10 min. o fins que s’evapori tot l’etanol.

9. Afegir 50 μL de TE 1x o aigua. Guardar a 4ºC.