5. OBTENCIÓ D'UN ADN RECOMBINANT

Durada aproximada del protocol: 1 dia

DESCRIPCIÓ

A la unió de l'insert d'interès i el vector se l'anomena lligació. Consisteix enbarrejar en un tub el vector, l'insert (en el nostre cas la resta de producte de PCR que hem reservat i purificat), i l'enzim lligasa, que s'encarrega de la seva unió.

MATERIALS I EQUIPS NECESSARIS

  • Insert d’interès (ADN) quantificat

  • Vector (quantificat)

  • Microtubs de 1.5 ml

  • Micropipetes 10µl -100µl i 100µl-1000µl

  • Enzim lligasa

  • Tampó lligasa

  • Aigua mil·liQ

METODOLOGIA (segons el protocol del manual del pGEM T-easy)

  1. Barrejar els components començant per l’aigua i acabant per l’enzim, segons la següent taula:

Taula 1. Quantitats corresponents de cada reactiu per l'obtenció d'un ADN recombinat corresponent el protocol del manual pel pGEM T-easy.

*La proporció aconsellada és 3 molècules d’insert per 1 molècula de plàsmid, fent servir la fórmula:

2. Deixar la lligació durant tota la nit a 4°C. El producte final de la lligació és l'ADN recombinant.