6. TRANSFORMACIÓ DE CÈL·LULES COMPETENTS

Durada aproximada del protocol: 1 dia

DESCRIPCIÓ

La transformació de cèl·lules d’E.coli competents s’utilitza per amplificar ADN recombinant.

INFORMACIÓ ADDICIONAL SOBRE ELS DIFERENTS REACTIUS UTILITZATS EN LA PRÀCTICA

MEDI LB:

Bactotriptona 100 g/L, extracte de llevat 5 g/L i NaCl 10 g/L. Ajustar el pH a 7.5 amb NaOH. Per al medi sòlid s’afegeix 15 g/L d’agar. Esterilitzar per calor humit (mitjançant autoclau de vapor d’aigua a 120ºC i una atmosfera de pressió, durant 20 min).

AMPICIL·LINA (antibiòtic)

  • Concentració stock, 100 mg/mL

  • Concentració treball, 100 μg/mL.

IPTG (inductor)

  • Concentració stock 23,8 mg/mL.

  • Concentració treball 23,8 μg/mL.

X-GAL (substrat de la B-galactosidasa)

  • Concentració stock 20 mg/mL

  • Concentració treball 40 μg/mL.

MATERIALS I EQUIPS NECESSARIS

  • Alíquota de cèl·lules competents

  • ADN recombinant que es vol amplificar, quantificat

  • Medi de cultiu LB líquid

  • Plaques amb medi de cultiu LB sòlid que contingui els agents de selecció

  • Gel

  • Block tèrmic

  • Incubador amb agitador

  • Campana de flux laminar

  • Estufa de 37ºC

  • Microtubs de 1.5 ml

  • Micropipetes 10µl -100µl i 100µl-1000µl

  • Pipetes i puntes estèrils

  • Cremador bunsen

  • Alcohol

  • Nansa de sembra

METODOLOGIA

  1. Descongelar en gel el tub que conté una alíquota de cèl·lules competents.

  2. Afegir 1-5 μL (10-20 ng) d’ADN recombinant i barrejar suaument.

  3. Mantenir la barreja 30 min. en gel.

  4. Fer un xoc tèrmic 1.5 min. a 42ºC.

  5. Transferir el tub a gel durant 2 min.

  6. Afegir 900 μL de medi LB fresc sense antibiòtics. Posar el tub en agitació a 250 rpm a 37ºC 1h.

  7. Plaquejar diferents volums de la transformació en dues plaques de LB sòlid amb l’antibiòtic selectiu escaient.

  8. Incubar els bacteris a 37ºC O/N.

Figura 1. Transformació de les cèl·lules competents.