Embedded Files
Durada aproximada del protocol: 1 dia
DESCRIPCIÓ
La transformació de cèl·lules d’E.coli competents s’utilitza per amplificar ADN recombinant.
INFORMACIÓ ADDICIONAL SOBRE ELS DIFERENTS REACTIUS UTILITZATS EN LA PRÀCTICA
MEDI LB:
Bactotriptona 100 g/L, extracte de llevat 5 g/L i NaCl 10 g/L. Ajustar el pH a 7.5 amb NaOH. Per al medi sòlid s’afegeix 15 g/L d’agar. Esterilitzar per calor humit (mitjançant autoclau de vapor d’aigua a 120ºC i una atmosfera de pressió, durant 20 min).
AMPICIL·LINA (antibiòtic)
Concentració stock, 100 mg/mL
Concentració treball, 100 μg/mL.
IPTG (inductor)
Concentració stock 23,8 mg/mL.
Concentració treball 23,8 μg/mL.
X-GAL (substrat de la B-galactosidasa)
Concentració stock 20 mg/mL
Concentració treball 40 μg/mL.
MATERIALS I EQUIPS NECESSARIS
Alíquota de cèl·lules competents
ADN recombinant que es vol amplificar, quantificat
Medi de cultiu LB líquid
Plaques amb medi de cultiu LB sòlid que contingui els agents de selecció
Gel
Block tèrmic
Incubador amb agitador
Campana de flux laminar
Estufa de 37ºC
Microtubs de 1.5 ml
Micropipetes 10µl -100µl i 100µl-1000µl
Pipetes i puntes estèrils
Cremador bunsen
Alcohol
Nansa de sembra
METODOLOGIA
Descongelar en gel el tub que conté una alíquota de cèl·lules competents.
Afegir 1-5 μL (10-20 ng) d’ADN recombinant i barrejar suaument.
Mantenir la barreja 30 min. en gel.
Fer un xoc tèrmic 1.5 min. a 42ºC.
Transferir el tub a gel durant 2 min.
Afegir 900 μL de medi LB fresc sense antibiòtics. Posar el tub en agitació a 250 rpm a 37ºC 1h.
Plaquejar diferents volums de la transformació en dues plaques de LB sòlid amb l’antibiòtic selectiu escaient.
Incubar els bacteris a 37ºC O/N.
Figura 1. Transformació de les cèl·lules competents.
Page updated
Report abuse